分子生物学技术原理

分子生物学：在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程。比如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等CRISPR/Cas9:是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA 的片段整合到CRISPR 中，并利用相应的CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。此系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。

宏基因组：也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组）即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学(或元基因组学，metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。

细胞表面展示：表面展示（surface display）是一种新的基因操作技术，使表达的多肽以融合蛋白形式展现在核糖体、病毒或细胞表面，保持相对独立的空间结构和生物活性。借以研究多肽的性质、相互识别和作用，筛选特定功能的多肽结构，实现蛋白质的固定化和定向进化。纽荷尔晶界观察显微镜ABS塑料观察。噬菌体表面展示技术和酵母表面展示技术是应用最广泛的技术，流式细胞仪在各种展示技术中的高效准确的筛选应用也越来越被关注和使用。

基因克隆：采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程叫基因克隆。

抗体：是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。

蛋白印迹，也称为免疫印迹，是一种分析和鉴定特定蛋白质的技术，用来检测在不均一的蛋白质样品中是否存在目标蛋白的一种方法。即将混杂的总蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至固相膜(如硝酸纤维素膜、尼龙膜和PVDF膜等)上，再用特定蛋白质抗体进行免疫反应，显色后，可显示出该特定蛋白是否存在及其表达量。

修饰酶：能催化稀有碱基参入RNA或DNA，或对原有碱基进行修饰的酶。以防止限制性内切酶的破坏。体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，而使其在高活性形式和相对较低的活性形式之间互相转变，这种调节称为共价修饰调节，这类酶称为修饰酶。例如某些酶的巯基发生可逆的氧化还原，一些酶以共价键与磷酸、腺苷等基团的可逆结合，都会引起酶结构的变化而呈现不同的活性。酶的共价修饰是体内代谢调节的另一重要的方式。

荧光定量PCR技术（Real-Time PCR）：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，对未知模板进行定量分析的方法。其对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量分析；特异性强；灵敏度高；可直接对产物进行定量；可解决PCR污染问题；自动化程度高、操作简单。

cDNA文库:以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。DNA文库:DNA 或DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中, 通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系(克隆),在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部DNA都包含在内的情况下,这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。

Taq酶：是一种耐热的DNA聚合酶，已发现于水生嗜热菌内故而得名，可以耐受90C以上的高温而不失活，常见于PCR技术，用于大量扩增DNA片段。流动相:色谱过程中携带待测组分向前移动的物质称为流动相,是与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相,用作流动相的物质有气体、液体、超临界流体。

固定相:是色谱柱内不移动的活性物质称为固定相,是色谱分析中的关键,混合组分的分离,主要取决于固定相的选择。

限制性内切酶: 限制性内切酶(restriction endonuclease,RE)是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸顺序(一般具有双重对称的回文结构),并以内切方式水解双链DNA的核酸水解酶。

示踪分子：用于标记DNA序列或蛋白质，使之可遗传并被检出的物质，有放射性和非放射线两种。

绿色荧光蛋白由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色荧光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾（sea pansy）所得的绿色荧光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene）。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色荧光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物（例如：兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。基线:在正常操作条件下仅有载气通过检测器时所产生的响应信号曲线。

漂移：基线向某个方向稳定移动。

噪音：仪器本身所固有的，以噪音带表示。

保留时间: 组分从进样到出现峰最大值时所需的时间，即各组分通过色谱柱所需要的时间。

气相色谱(GC)：主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。用于可挥发、热稳定、沸点不超过500℃的化合物（20%-25%）待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体（即载气，也叫流动相）带入色谱柱，柱内含有液体或固体固定相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，造成每种组分在流动相和固定相之间形成分配或吸附不同而分离的的一种技术。

液相色谱：不受样品挥发度和热稳定性的限制，纽荷尔晶界观察显微镜ABS塑料观察。它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，分析对象为可以溶于水或有机溶剂的各种物质，大约占各种有机物的70%-80% 。

*高效液相色谱（HPLC）：高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

*超高效液相色谱（UPLC）：在传统的HPLC的基础上通过运用粒径低于2μm的小颗粒来提高色谱柱的柱效，从而相对于传统的液相色谱具有更高的分离度、速度和灵敏度。

*激光扫描共聚焦显微镜：利用激光点作为荧光的激发光并通过扫描装置对标本进行连续扫描，并通过空间共轭光阑（针孔）阻挡离焦平面光线而成像的一种显微镜。是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。*二维电泳（2-DE）：是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段流动相：色谱过程中携带待测组分的向前移动的物质成为流动相，是与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相用作流动相的油气体、液体、超临界流体蛋白质组学(proteomics)指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。

基因组学（英文genomics），研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。用于概括涉及基因作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学分支。该学科提供基因组信息以及相关数据系统利用，试图解决生物，医学，和工业领域的重大问题。基因组研究应该包括两方面的内容：

以全基因组测序为目标的结构基因组学（structural genomics）和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学（functional genomics)，又被称为后基因组（postgenome）研究，成为系统生物学的重要方法。

基因芯片：该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400 ）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。用来大规模检测基因转录。

探针：在分子杂交中用来检测互补序列的带有标记的单链DNA或RNA片段。

EMBL：（欧洲分子生物学实验室）由欧洲30个成员国政府支持组成，纽荷尔晶界观察显微镜ABS塑料观察目的在于促进欧洲国家之间的合作来发展分子生物学的基础研究和改进仪器设备、教育工作等。分7个部分：结构、分化、物理仪器、生化仪器、生物仪器、计算机和应用数学。目前,在研究中已经建立了先进的核苷酸序列数据库。

5、NCBI：(美国国立生物技术信息中心)它的目的是建立关于分子生物学，生物化学，和遗传学知识的存储和分析的自动系统。实行关于用于分析生物学重要分子和复合物的结构和功能的基于计算机的信息处理的，先进方法的研究。加速生物技术研究者和医药治疗人员对数据库和软件的使用。全世界范围内的生物技术信息收集的合作努力。挑战在于发现新的手段去处理这些数据的容量和复杂性，并且为研究人员提供更好的便利来获得分析和计算的工具，以便推动对我们遗传之物和其在健康和疾病中角色的理解。NCBI的任务是发展新的信息学技术来帮助对那些控制健康和疾病的基本分子和遗传过程的理解。

细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome，BAC）是指一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对。

2、内切酶:内切酶，即限制性核酸内切酶。亦称限制性核酸酶。是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸顺序,并以内切方式水解双链DNA的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase）,它们的切点大多很严格，要求专一的核苷酸顺序——识别顺序。

4、绿色荧光蛋白（GFP）：这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria 的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene）。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色荧光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物（例如：兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。

6、核酸杂交：两条核酸单链可以通过序列互补形成双链化合物的过程。有DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等杂交类型。核酸杂交是一种很重要的、被广泛应用的技术，如设计反义核酸、合成探针等。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交和RNA印迹杂交。利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。

常用的核酸分子杂交技术有：原位杂交、斑点杂交、Southern杂交及Northern杂交等。

在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。

这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针。