纽荷尔水质检测显微镜有关细胞或组织总蛋白提取与浓度测定（BCA法）

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来源: | 作者:纽荷尔显微镜 | 发布时间 :2024-04-12 | 121 次浏览: | 🔊 点击朗读正文 ❚❚ ▶ | 分享到:

细胞或组织总蛋白提取与浓度测定（BCA法）

实验步骤

细胞或组织总蛋白提取与浓度测定

1 细胞总蛋白提取（冰上防止蛋白裂解）

1）吸去培养皿中的培养基，加入1 ml预冷PBS缓冲液洗3次。

2）加入适量含1×蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液（10 cm培养皿中一般加入500 μl,六孔板一般100微）。

3）冰上裂解15-30 min，将裂解后的细胞用细胞刮子刮下，吸入1.5ml离心管中。（这个裂解时间的长短有没有影响不清楚，本人之前刮细胞太慢，常常最后一个刮完后第一个已经裂解了好久，可能都要一个小时了，应该问题不大）

4）在4℃条件下，12,000 rpm离心15 min，收集上清，即为细胞总蛋白。

2 小鼠组织总蛋白提取

1）取小鼠组织约50-200 mg，加入500 µl预冷的含1×蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液。

2）将小鼠组织剪碎，并用组织匀浆器匀浆。

3）冰上静置30 min。

4）在4℃条件下，12,000 rpm离心30 min。收集上清，即为组织总蛋白。

3 蛋白浓度测定（BCA法）

利用北京普利莱的BCA蛋白定量试剂盒（P1511）进行蛋白浓度测定，具体操作步骤如下：

1）将BCA蛋白定量试剂盒中的BCA Reagent和Cu Reagent按照50:1的比例配制成BCA工作液。

2）将4 mg/ml的BSA溶液倍比稀释，配置成浓度为4、2、1、0.5、0.25及0.125 mg/ml的BSA溶液作为蛋白标准品。

3）在96孔板中每孔加入100 µl BCA工作液，再加入5 µl蛋白样品或标准品，每个蛋白样品需设两个平行孔，充分混匀，注意尽量避免出现气泡，37℃孵育30 min。（这个时间说明书写的可室温俩小时，我在37度也放过很久，吃完饭回来就去测）

以BCA溶液作为空白对照，使用酶标仪测定595nm处的吸光度值。通过酶标仪自带软件拟合曲线并计算每个样品的蛋白浓度。

RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。（感觉这个总结不错）弱的裂解液适合做co-ip，如果是胞浆蛋白，对裂解液强度要求不高，如果是膜蛋白，要强裂解液。加了SDS裂解能力就比较强。纽荷尔水质检测显微镜使用视频。

一些成分

RIPA裂解液(强)的主要成分为50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1%TritonX-100，1% sodium deoxycholate脱氧胆酸钠，0.1% SDS，以及2mM sodium pyrophosphate，25mM β-glycerophosphate，1mM EDTA，1mM Na3VO4，0.5 ug/ml leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白降解。

RIPA裂解液(中)的主要成分为50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate。

裂解液中脱氧胆酸钠和原矾酸钠的作用

前者是离子型去垢剂，后者是抑制酪氨酸磷酸酶活性的。

离子型去垢剂主要作用有：1、裂解细胞；2、溶解蛋白，尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白，如膜蛋白等；3、很适合做WB，但在Co-IP中使用，需要谨慎。

Sodium pyrophosphate tetrabasic，中文名为焦磷酸钠四元，也称无水焦磷酸钠、磷酸四钠或TSSP，是由焦磷酸盐和钠离子组成的盐，在实验室中用作缓冲剂。已证明其可用于制备用于土壤样品微囊素分析的EDTA-焦磷酸钠萃取缓冲剂。磷酸钠也是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶不可逆抑制剂。

β-Glycerophosphate (sodium salt hydrate)，别名Glycerol 2-phosphate，简称β-GP，中文名为五水beta-甘油磷酸钠，或beta-磷酸甘油酯二钠盐五水合物，是小牛肌醇-1-磷酸酶的底物，也是一种经典的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶可逆抑制剂和磷酸酶-张力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten, PTEN)的抑制剂，用于激酶反应缓冲剂。β-Glycerophosphate常与其它磷酸酶以及蛋白酶抑制剂结合使用，用于广谱抑制。

NP-40是一种很温和的非离子型去垢剂，1%浓度基本可以破坏掉细胞膜，而对核膜的破坏作用较弱，结合特定的缓冲液可以获得胞浆蛋白。与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解。

PMSF:可抑制丝氨酸蛋白酶例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，也可抑制半胱氨酸蛋白酶和乙酰胆碱酯酶。

纽荷尔水质检测显微镜使用视频。

EDTA: 乙二胺四乙酸（EDTA）是一种有机化合物，其化学式为C₁₀H₁₆N₂O₈，常温常压下为白色粉末。它是一种能与Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺等二价金属离子结合的螯合剂。由于多数核酸酶类和有些蛋白酶类的作用需要Mg²⁺，故常用做核酸酶、蛋白酶的抑制剂；也可用于去除重金属离子对酶的抑制作用。