1、细胞工程的定义及特点？

细胞工程（cell engineering）：是指主要以细胞为对象，应用生命科学的理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞，组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。

细胞工程的特点：

                前沿性：现代生物技术的热点

                争议性：新技术给伦理道德带来的冲击

                综合性：多学科交叉

                应用性：工程类课程，重在产品与技术

植物再生的理论基础：细胞全能性（是指分化细胞保留着全部的核基因组，纽荷尔细菌检测显微镜知识点，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能）。

植物组织培养的再生途径有哪两种？

  ⑴ 器官发生途径：成熟细胞---愈伤组织---出根出芽---完整植株。

                   （离体的植物器官、组织、细胞--------愈伤组织--------根芽----植物体）

  ⑵ 体细胞胚发生途径：成熟细胞----分生细胞-----胚状体----完整植株。

植物细胞几种大规模培养系统各有什么特点？

⑴悬浮细胞培养：在愈伤组织体液培养的基础上发展起来，是指将单个有力细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增值的技术。

       特点：细胞可以不断增值，形成高密度的细胞群体，斌且适于大规模培养，可大量提供较均匀的细胞，为深入细致地研究细胞的生长、分化创造了一个很好的实验方法和条件。

⑵ 植物细胞固定化培养：把细胞固定在一种惰性基质上，如琼脂、藻酸盐、聚丙烯酰胺和纤维膜等，细胞不能运动，而营养液可以在细胞间流动，供应细胞营养的培养方法。

优点：①细胞经过包埋后所到的剪切力损伤减小，维持了细胞的稳定性，适合脆弱的植物细胞的培养，同时也利于采用传统生物反应器大规模培养。

         ②悬浮细胞培养体系中细胞密度比较高时会因粘度增加儿引起传质困难，固定化细胞培养系统中细胞密度远高于悬浮培养，但并不会改变培养液流体性质，利于传代。

         ③大多数植物次级代谢产物合成在生长停止后才大量合成。采用固定化培养可以将细胞生长与产物合成分成两个阶段

         ④ 细胞生长较为缓慢，利于次级代谢产物的积累

         ⑤固定化增加了细胞与细胞间的接触，促进了细胞间信息传递，利于代谢产物的合成；

         ⑥固定化细胞可以反复使用，可以方便的进行产物的连续性收获，降低了成本。

缺点：①固定化细胞培养要求代谢产物必须是分泌到细胞外。但次级代谢产物多是存在于细胞内的，为促进次级代谢产物的合成和分泌，需要借助表面活性剂或对细胞进行透性改造。

          ②植物细胞次级代谢产物的积累不是连续的，这也是限制了固定化细胞方法的应用。

  ⑶ 植物器官培养：包括毛状根培养、芽培养、体细胞胚培养。

    根据不同的培养体系，不同的培养目的，确定不同类型的生物反应器，是植物大规模培养技术应用的关键。

1、什么是植物快繁技术？总结其主要步骤。

  植物快速繁殖：是指利用组织培养技术，将优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传性状一致的植株的技术。

  主要步骤：①无菌母体植株的植被 ②不定芽的增值 ③完整植株的形成 ④再生植株的驯化 ⑤再生植株的鉴定 ⑥移栽

4、微繁殖中芽的增值方式有哪些？

 ⑴ 侧芽（腋芽）途径：（原理）有的植物具有大量腋芽，由于顶端优势效应，这些腋芽的生长在整体植株上被顶芽抑制。若将腋芽分离下来，给以适当的培养条件，即可形成大量的不定芽，进而再生为植株。

 ⑵器官发生途径：从器官外植体诱导不定芽。不定芽是指现存芽以外的任何器官、组织上通过器官发生重新形成的芽。

       特点：繁殖系数高；遗传稳定性好；继代次数有限。

 ⑶胚状体增值：（特点）增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率还不高。目前除一些特殊用途（人工种子），这一途径还没有用于快繁技术。

1、为什么说原生质体培养是现代生物技术的载体？

去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体。特点为：无细胞壁，可以方便的进行遗传操作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操作。具有全能性，能再生细胞壁。是最简单的细胞形态，有许多优良的性质，在细胞工程方面有很多应用，可以说它是现在生物技术的载体

2、细胞融合的原理、方法与关键环节？

 原理：细胞膜是由磷脂双分子层和镶嵌、贯穿在其中及吸附在其表面的蛋白质组成的，磷脂双分子层疏水的尾部在内，亲水头部在外，具有一定流动性，蛋白质也是如此，即利用细胞膜具有流动性的原理。

 方法：可以采用化学诱导剂，包括NaNO3、高pH的高浓度Ca²¯离子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明胶、抗体等

       物理法：电融合诱导法、BLS流式细胞融合仪、电击法。

 主要环节：①亲本选择（单细胞或原生质体制备） ②两原生质体或细胞互相靠近，粘附   ③质膜融合形成细胞桥

④胞质渗透  ⑤细胞核融合 ⑥融合细胞筛选

 关键环节：细胞核的融合。(若没有发生细胞核的融合，仅发生了细胞质的融合，则可能嵌合细胞。含有多个核的异核细胞合并后形成的单核细胞称为合核细胞。细胞核的发生在有丝分裂过程中。但这种有丝分裂只有当两个核的DNA合成才能发生：两个核同时进行有丝分裂，形成一个纺锤体，全部染色体都排列在一个赤道板上，结果伴随着细胞分裂就形成了单核的子细胞，纽荷尔细菌检测显微镜知识点，其细胞核中含有双亲细胞的染色体。)

2、简述根瘤农杆菌进行基因转化的步骤及其原理。

原理：农杆菌是普遍存在于土壤中的革兰氏阴性菌，能在自然条件下趋化性的感染大多数的双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。根瘤农杆菌中的细胞含有Ti质粒，其上有一段T-DNA。农杆菌通过侵染植物的伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中；T-DNA上的基因利用植物的酶系统进行那个转录和翻译，其表达产物可诱导肿瘤形成。人们将目的基因插入到经过人工改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

    根瘤农杆菌Ti质粒的基因结构主要分为T-DNA区、Vir区、Con区和Ori区4个区段。T-DNA区称为转移DNA区。能够转移整合入植物受体基因组，并不能在植物细胞中表达，从而导致冠瘿瘤发生。Vir区与T-DNA区相邻，由多个毒性基因组成，其编码蛋白对T-DNA的转移和整合必不可少。该基因可激活T-DNA的专一，使植物致瘤，故称毒性区。Con区段上存在与细菌结合转移有关的基因，调控Ti质粒在根癌农杆菌中的转移，故称为结合转移编码区。Ori区主要调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。

步骤：⑴对植物表面部位的识别和附着：植物伤口分泌的酚类小分子物质可以诱导Vir基因活化并表达

⑵T-DNA进行复制和转移：Vir产物能诱导Ti质粒复制产生一新的单链T-DNA分子，并使其转移到植物细胞中。

⑶T-DNA的整合：在Vir产物作用下，T-DNA转入细胞核，并整合到植物染色体上。

1、动物细胞体外生长有什么特点？

  体外生长的动物细胞一般具有细胞接触性抑制、密度抑制的特点、贴附。

接触性抑制：是某些动物细胞体外培养的生长特性之一。是指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象。由于这个特性。正常细胞不会相互重叠，而呈单细胞生长。

密度抑制：细胞接触汇合成片后，只有营养充分，细胞仍能进行增值分裂。但是当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制现象。

   贴附：贴附并伸展是贴壁型细胞体外培养时基本生长特点。

2、动物细胞培养基的主要分类（三类）？

⑴天然培养基：来自动物细胞体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。优点：含有丰富的营养物质及各种细胞生长因子，激素类物质，渗透压、pH等也与体内环境相似。缺点：成分复杂、来源受限、制作过程复杂、批次间生产差异大。

  血清：纤维蛋白已被去除的（如通过血凝或去纤维蛋白法）的血浆。

（2）合成培养基：优点：成分已知，便于对实验条件进行操作。缺点：无法取代一些未知成分。解决途径：合成培养基中添加小牛血清，彼此互补。常用合成培养基有：MEM DMEM F12 M199 RPM1640

（3）无血清培养基：是不含血清的动物细胞培养基，由基础培养基和添加组分组成，试图全部替代血清成分。基础培养基较为常用：DMEM、F12培养基。添加组分主要包括：细胞外基质、生长因子结合蛋白和转运蛋白、酶抑制剂等。

（4）其他平衡溶液：平衡盐溶液、细胞消化液等（P57）

1、杂交瘤生产单克隆抗体的制备原理与技术流程？

原理：将杂交瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到既能够分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。这种技术称为杂交瘤技术。

技术流程：

⑴动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备：一般要经过初次免疫、第二次免疫（向动物腹腔内注射抗体）、加强免疫（向动物静脉内注射抗体）三个过程，如果需要免疫脾细胞，纽荷尔细菌检测显微镜知识点，一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液

⑵骨髓瘤细胞的获得与培养：骨髓细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高。通常采用鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）缺陷型的骨髓瘤细胞系。一般在准备融合细胞钱的两周就应开始附属骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。

⑶细胞融合：取对数生长期的骨髓瘤细胞，离心，弃上清。用PEG作用下，融合杂交瘤细胞。

⑷融合细胞的筛选：融合后的细胞类型：融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体等。正常的脾细胞在培养基中存活5—7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。剩余：脾细胞+瘤细胞的融合细胞+未融合的瘤细胞+融合的瘤细胞，其中后两种需要进行特别的筛选去除。

⑸克隆化培养：将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一个孔中的细胞数在0至数个细胞之间。培养一段时间后去上清以ELISA法选出抗体高分泌性的抗体。找到针对目标抗原的抗体，增殖后冻存、体外培养或动物腹腔接种培养生产抗体。

⑹分泌抗体的融合细胞的筛选：酶联免疫吸附法（ELISA）：主要是基于抗原或抗体能够吸附至固定相载体的表面并保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。

⑺单克隆抗体的大来那个生产：实体瘤法、腹水制备法、生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗。

2、HAT培养基的选择原理：

原理：HAT培养原理是根据细胞由次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸合成DNA途径而设计的。正常细胞合成DNA途径有主要途径和补救途径。主要途径中，叶酸及其衍生物是必不可少的媒介，参与嘌呤环的和嘧啶甲基的合成。氨基蝶呤抑制二氢叶酸还原酶活性，从而阻断正常细胞中DNA合成主要途径中二氢叶酸到四氢叶酸合成。因此，只有利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷酸等前提的野生型细胞才能从补救途径合成DNA而不会死亡。这些野生型细胞内具有次黄嘌呤---鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK），如果缺乏其中一种，补救途径就不能发挥作用。

  主要途径：糖、氨基酸—--核苷酸---DNA   可以被氨基蝶呤阻断

  补救途径：核苷酸前体----核苷酸---DNA    

⑴氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成DNA，因此HAT培养基上的细胞不能采用此合成途径。

⑵融合所以的瘤细胞一般是鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）缺陷型，因此也不能采用补救途径合成DNA。

⑶瘤细胞的命运（未融合的和多聚体）命运，因不能正常合成DNA而死亡。

⑷融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞内的鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）

           因此可利用培养基中的嘌呤和嘧啶采用补救途径合成DNA,因此可在HAT培养基中存活和繁殖。

  简述植物细胞培养单细胞分离方法及培养方法。

分离方法：1)机械法：将叶片轻轻研碎，经过滤和离心，收集和净化细胞。 2）酶法：利用果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他外植体，使细胞分离 。3）化学法：利用一些化学药剂游离细胞，如草酸钙，秋水仙素等。

 培养方法  1）细胞悬浮培养：将植物游离细胞或细小的细胞团在液体培养基中培养。 2）看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增值。 3）平板培养：将一定细胞密度的单细胞悬浮液与加热融化后冷却至35°未凝固的含琼脂培养基混合，再迅速倒入培养皿形成一平板进行培养。 4）微室培养：在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团。

  植物原生质体的分离和培养有哪些主要的步骤？

分离方法：1）机械分离法：借助于利器或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放。2）酶解分离法：将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，使细胞壁被降解，获得有活力的原生质体。原生质体培养包括原生质体分离、纯化、活力测定、原生质体培养及植株再生等步骤。

4、为什么用茎间做外植体能培养出脱毒苗？

茎尖培养脱毒的原理：病毒在感染植物上分布不一致，即在老叶片及成熟的组织和器官病毒含量较高，而幼嫩的及未成熟的组织和器官病毒含量较低，生长点（0.1~1mm区域）则几乎不含或很少。纽荷尔细菌检测显微镜知识点。  茎尖（分生组织）无病毒可能存在的原因：  （1）在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但分生组织中不存在维管束系统。 （2）病毒在细胞间移动的另一个途径是胞间连丝，然而，它的速度很慢，难以追上活跃生长的茎间。分生组织分化速度大于病毒传播速度。  （3）在茎尖中存在高水平的内源生长素，可抑制病毒的增殖。

6、动物细胞体外培养有哪些类型？

（1）贴附型细胞  （1）成纤维型细胞   细胞大致呈梭形，多数细胞间排列松散，有较大的细胞间隙，起源于胚肺细胞。  （2）上皮型细胞   细胞扁平状，形态较为规则，排列紧密，呈“铺路石状”，起源于内胚层与外胚层的细胞。  （3）游走型细胞   外形不规则且不断变化，生长位置不固定。如具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞。  （4）多形型细胞   形态不规则，一般分胞体和胞突两部分，如神经元和神经胶质细胞。 （二）非贴附型细胞（悬浮细胞）  细胞体外生长不必贴壁，密度较高，胞体始终为球形。如血液白细胞、淋巴组织细胞等。