细胞生物学的概念

1.细胞生物学的概念以及研究内容

概念：研究细胞及其生物学功能的科学。

研究内容：

以细胞为研究对象，纽荷尔精密零件检测显微镜为实验室分析辅助，从细胞的整体水平、亚显微水平、分子水平三个层次，以动态的观点研究细胞和细胞器结构和功能、细胞生活史和各种生命活动规律的学科。

2.细胞生物学的发展简史

细胞生物学的发展大致分为四个时期：细胞的发现及细胞学说的创立

2.1.1 1665年，胡克利用自己制造的显微镜观察栎树软木塞切片，观察到蜂窝状小室（死细胞），并将其称为“cella”。1674年，列文虎克利用自制的高倍显微镜，第一次观察到了完整的活细胞。

2.2.2施莱登、施旺提出了细胞学说，即地球上的生物都是由细胞构成的，所有的生活细胞在结构上都是类似的。后由威尔肖补充，所有的细胞都是来自于已有的细胞的分裂。细胞学说创立论证了生物界的统一性和生命的共同起源。

细胞学的经典时期：1875-1900年，细胞学说的推动，固定和染色技术、显微镜技术的发展，使细胞生物学有了进一步的发展，集中在细胞结构组成以及分裂方面。

实验细胞学时期：此时期的特点是利用实验的手段从形态结构的观察深入到生理功能、生物化学、遗传发育机制的研究，并且同相邻学科互相渗透，互相发展。

细胞生物学概念的提出：1965年，derobetis将其编着的《普通细胞学》改为《细胞生物学》，标志细胞生物学的诞生。

3.细胞概述：细胞的共性

3.1.1 细胞结构的共性：都具有选择性的膜结构、遗传物质、核糖体。

选择性膜结构能够维持内环境的稳定性，使物质、能量、信息交流等稳定进行；细胞都具有遗传物质，最早的遗传物质是RNA，后逐渐进化形成DNA；细胞具有核糖体，保证遗传信息能够正常表达。

3.1.2 细胞功能的共性：遗传信息流；繁殖；网络系统式的生化反应和谐体。细胞遗传信息的复制、表达；细胞都能进行新陈代谢，新陈代谢即是由酶促反应构成及酶调控的网络系统。

3.1.3 细胞形态体现了结构和功能的协调适应。细胞的大小维持恒定，受三方面的限制：细胞表面积与体积的比例，以维持与环境正常的物质、能量、信息交流速度；细胞核的能力范围，协调细胞内各种功能的实现；维持细胞生命活动所需的酶和蛋白质最低量。

细胞的分子基础

水、无机盐、蛋白质、糖类、脂类、核酸等。

水的物理化学特性：水具有极性，能够形成氢键；高比热，蒸发热；高表面张力，内聚力；

水在细胞中的功能：溶剂，反应介质；结构成分；参与新陈代谢反应；

细胞结构体系的组装

3.3.1 生物分子组装成细胞，粗略地分为四级：小分子有机物的形成；小分子有机物构成生物大分子；生物大分子组装成细胞的高级结构；高级结构以及生物大分子组装成细胞器、细胞。

3.3.2 组装模式假说有三种：模版组装；酶效应组装；自组装。

细胞的类型和结构体系构成

3.5细胞生命的进化与非细胞生命体病毒

细胞生物学研究方法

细胞生物学以细胞为研究对象，从细胞的整体水平、亚显微水平、分子水平三个层次，以动态的观点研究细胞和细胞器结构和功能、细胞生活史和各种生命活动。

1．细胞结构、成分的观察-显微成像技术

原理：照明系统发出的光线或电子束通过样品时，与样品发生相互作用，其被改变的物理特征被肉眼观察或通过探测器检测而成像。

分辨率：r=λ/nsinα；分辨极限：一定波长的射线不能用以探测比它本身波长短得多的结构细节。

普通光学显微镜及样品制备

1.1.1各种光学显微镜

普通光学显微镜

荧光显微镜：利用紫外线为光源照射样品，使之发生荧光。

相差显微镜：将不同成分的衍射系数改变为明暗变化。

暗视野显微镜：利用散射或衍射光增大反差。

倒置显微镜：普通光学显微镜的倒置。

1.1.2样品制备

取材、固定（杀死细胞，稳定细胞的成分，形成一定硬度）、包埋、切片、染色、观察。

放射性自显影：放射性同位素标记、底片。

电子显微镜及其样品制备

1.2.1电子显微镜

透射电子显微镜

照明系统为电子束，电磁透镜调整电子束的亮度与聚焦，真空系统保护电子枪等。

扫描电子显微镜

极狭窄电子束扫描样品，利用样品表面形成的二次电子信号成像。

扫描透射电子显微镜

透射电子显微镜与扫描电子显微镜的结合：电子束扫描，透射电子成像。

1.2.2样品制备

步骤：取材、固定、包埋、切片（超薄切片）、染色（负染色等）、观察（放在载网上）。

负染色：利用重金属盐对样品进行染色，电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。

喷镀技术：以一定角度在样品的表面镀上一层金属，增强背景和待观察样品反差的方法。

冷冻断裂复型和冷冻蚀刻：生物样品在液氮中迅速冷冻，然后迅速放入冷冻装置中，并迅速抽成真空，用冰刀切割，然后观察切口表面；或将其温度稍微升高，使样品中的冰升华，会在表面浮雕出细胞膜的超微结构。

间接成像技术

扫描隧道显微镜：利用量子力学的隧道效应，纽荷尔精密零件检测显微镜为实验室分析辅助探针尖端与样品表面可产生隧道电流，其值与距离呈指数变化关系。

原子力显微镜：扫描隧道显微镜修改，利用探针原子与样品表面的原子力的变化。

X射线衍射技术：在原子分辨的水平上推测分子的结构。

2．细胞成分的组成、分布-细胞化学技术

酶细胞化学技术

初级反应：细胞内酶作用于底物产生初级反应产物。

捕捉反应：初级反应产物与捕捉剂相互作用，产生显微镜下可见的最终反应产物。

免疫细胞化学技术

利用免疫反应定位组织或细胞中的抗原成分分布。包括免疫荧光技术和免疫电镜技术。

其它

显微分光光度术、显微荧光光度术用来对相关成分进行定性、定量、分布的观察。

核磁共振技术分析有机化合物结构。

3．细胞及成分的分离-细胞分选技术、分离技术

细胞分选技术

流式细胞仪：流室，激光光源，讯号检测器，讯号分析部件，无细胞液滴收集器。

细胞分选过程：细胞液经流室形成单细胞悬液，激光检测带有荧光标记的细胞，信号检测分析使液滴充电，经电场分选进入无细胞液滴收集器。

分离技术

3.2.1离心分离技术

（1）速度离心分离细胞器和大分子

在一定的离心速度下，不同大小的细胞器由于体积的不同，沉降速度也就不同，体积大的沉降快。

差速离心：采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。

移动区带离心：利用蔗糖或甘油制备轻微的连续密度，较长时间的离心。建立密度梯度的原因使防止扩散，但任一组分的密度都大于连续密度的最大值。

（2）等速度离心分离细胞器和大分子

利用介质产生一种密度梯度，覆盖了待分离物质的密度，通过离心使不同密度的颗粒停留在相应的介质密度区。

介质可以是蔗糖或甘油，其密度较小，适于分离细胞器等；或利用CsCl，能够自发建立密度梯度，同时密度比较大，适合分离DNA,RNA等。

3.2.2层析分离技术

根据混合物中各组分在物理化学性质等方面的差异在固定相与流动相间进行反复多次的分配而得以使各组分的移动速度产生差异而分离。

（1）凝胶过滤层析根据蛋白质的大小和形状进行分离纯化。

（2）亲和层析根据生物分子中有些分子的特定结合特性分离纯化成分。

（3）离子交换层析根据蛋白质在不同pH环境下具有不同的带电特性，而与固定相的特定电荷相互作用而分离纯化。

4．细胞培养-细胞工程技术在体外模拟体内的生理环境，培养从机体取出的细胞。

培养条件注意三个环节：营养、生存环境、废物的排除。

培养过程原代细胞培养产生细胞系，再经传代培养得到具有特殊性质或标志的细胞株。

培养方法悬浮培养、贴壁培养。

5．与其它学科结合的相关技术-单克隆抗体技术、显微操作技术、分子生物学方法等单克隆抗体技术B细胞与突变的骨髓肿瘤细胞发生细胞融合，产生既能产生单一抗体，又能不断增殖的杂种细胞。

显微操作术用于对细胞的解剖手术及微量注射的技术。

分子生物学方法

5.3.1基因工程

选择目的基因构建工程质粒，导入载体中表达，产生产品或进行基因功能的分析。

5.3.2 PCR技术

复制目的DNA片段。

步骤：引物设计和合成、DNA模版的制备、PCR反应、产物的分离和纯化。

5.3.3选择性基因Knockout和转基因鼠

目的基因插入正选择标记基因，末端插入负选择标记，导入胚胎干细胞，进行基因重组，然后筛选出正确重组的细胞，培养出杂种小鼠，经过两次交配得到纯合的基因knockout鼠。

5.3.4乳腺生物反应器技术

根据细胞生物学中蛋白质的合成与分选的机理，结合基因工程技术、生物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某种具有重要价值的基因产物。

细胞质膜与跨膜运输

概述

3.1.1定义

几个概念的区分：细胞质膜、内膜系统、生物膜；细胞质、原生质、细胞溶胶、原生质体。

（1）细胞质膜：包围在细胞表面的细胞膜。

内膜系统：细胞内部的封闭膜结构统称为内膜系统，如内质网、高尔基体等。

生物膜：包括细胞质膜及膜系统。

（2）细胞质：细胞膜内，不包括细胞核的细胞部分。

原生质：细胞质加上细胞核，即细胞膜内的所有部分。

胞质溶胶：细胞匀浆经除去所有细胞器和颗粒后的上清液部分，纽荷尔精密零件检测显微镜为实验室分析辅助，即不包括细胞器的细胞质部分。

原生质体：细胞膜加上原生质。

3.1.2质膜功能

（1）屏障作用，保护细胞，并维持膜空间环境的相对稳定性。

（2）参与细胞的识别、粘附，在细胞的迁移分化，细胞器、生物活性物质的功能定位等过程中发挥重要的作用。

（3）参与膜结构与外界环境之间物质、能量、信息的交流。膜结构的研究材料——红细胞

3.2.1红细胞作为研究材料的特点

（1）红细胞数量大，取材容易，价格便宜。

（2）红细胞的结构简单，成熟细胞内没有膜相细胞器，只有细胞质膜。

（2）红细胞质膜具有很大的变形性、柔韧性、可塑性。

3.2.2红细胞的膜结构

 3.2.2.1红细胞研究

红细胞的相关研究证明了细胞膜是包括脂的双层结构。

3.2.2.2红细胞结构

（1）红细胞的膜骨架

结构组成：由膜蛋白和细胞骨架，以及其它相关蛋白组成的网架结构。

功能：维持红细胞的形状，协助质膜完成多种生理功能。

（2）红细胞膜蛋白的组成

主要由三种蛋白：带3蛋白、血影蛋白、血型糖蛋白。

带3蛋白：二聚体的糖蛋白，多次穿膜蛋白。

-

Cl

交换通道。

血影蛋白：膜下纤维状蛋白，两个亚基反向平行排列，螺旋状，形成异二聚体，两个异二聚体头

头连接形成四聚体。

膜骨架组织者，参与带3蛋白与细胞骨架的连接。

血型糖蛋白：单次穿膜，细胞外结构结合糖链，富含唾液酸。

多种类型，决定血型；唾液酸富含负电荷，可以防止红细胞在循环过程中经过狭小的血管时相互聚集沉积在血管中。

其它：肌动蛋白，细胞骨架成分，多个血影蛋白结合位点。

锚定蛋白，连接肌动蛋白与带3蛋白。

带蛋白；内收蛋白。

 3.2.2.3脂质体

红细胞放在低渗溶液后制成的封闭膜结构。

功能：（1）研究膜蛋白的功能。

（2）制作打靶药物。

细胞质膜

  3.3.1细胞质膜的物质基础

3.3.1.1脂质

（1）组成：

包括三大类：磷脂、鞘脂、胆固醇。

磷脂：①结构

分子极性头端：各种磷脂酰碱基。

分子疏水尾端：两条链烃，14-24个偶数碳原子，有一条常有一个或几个双键。

②功能

构成细胞膜的基本成分；链烃的长度和不饱和度的不同可以影响磷脂的相互位置，进而影响膜的流动性。

鞘脂：鞘氨醇的衍生物。

胆固醇：①结构

羟基团组成的极性头部、非极性的类固醇环结构、非极性的链烃尾部。动物中含量较高，植物中不存在。酵母中为麦角固醇。

②功能：调节膜的流动性、加强膜的稳定性。

（2）膜脂的功能

①膜基本骨架。②膜蛋白的溶剂。③为某些膜蛋白维持构象，表现活性提供环境。

3.3.1.2膜蛋白

（1）组成

按其位置分为三类：整合蛋白（穿膜蛋白）、膜旁蛋白、脂锚定蛋白。

穿膜蛋白：一般以α螺旋穿膜；细菌孔蛋白以β折叠片穿膜。

膜旁蛋白：位于膜内外表面，以非共价键与膜上脂类连接。

脂锚定蛋白：与膜脂以共价键连接。

分为三类：在胞质内侧，以Cys（酰基化），Gly（异戊二烯化）连接；在胞质外侧，通过短的寡糖与GP相连。

（2）功能   Transport;Catalyze;Conjuction;Receptor 

（3）膜蛋白的研究方法

①膜蛋白的分离：去垢剂。

②膜蛋白的位置测定：非通透性的试剂对蛋白质进行标记或修饰实验进行测定。

③膜蛋白的功能研究：构建脂质体。

3.3.1.3膜糖

（1）组成存在方式：大部分与膜蛋白共价形成糖蛋白，小部分与脂质共价形成糖脂。与蛋白质的连接方式有两种：N-连接（天冬酰胺，内质网合成），O-连接（丝氨酸、苏氨酸，高尔基体合成）。

（2）功能接触抑制；信号转导；蛋白质分选；细胞保护。

 3.3.2膜的分子结构

3.3.2.1结构模型流动镶嵌模型

3.3.2.2膜不对称性

（1）表现：膜脂、膜蛋白、膜糖的不对称性。包括分布，种类等的不对称。

（2）功能：保证了生命活动的方向性。

（3）实验证明：冷冻断裂法；放射性标记法（膜蛋白位置的测定）；脂酶处理法（外翻脂质体）。

3.3.2.3膜的流动性

（1）表现：膜脂的流动性：侧向扩散；旋转；翻转（翻转酶）。

膜蛋白的流动性：膜蛋白一般不移动，除非行使功能，以保持构象的稳定；一些膜蛋白可以随机移动；一些膜蛋白直接移动到细胞的另一处；移动距离小。

（2）影响因素：脂肪酸链：疏水尾小，流动快；不饱和键多，流动快。

胆固醇：相变温度以上，限制膜流动性；相变温度以下，增加膜的流动性温度：温度高，流动性大。

（3）实验证明：人鼠细胞融合实验；淋巴细胞的成斑和成帽反应；荧光漂白恢复；电子自旋共振谱技术。

膜的功能——物质运输

3.4.1膜运输的形式与特点

根据运输时对ATP的需求，膜运输形式分为两大类：主动运输和被动运输。

3.4.1.1被动运输

根据运输时是否需要载体分为：扩散与促进扩散。

（1）扩散定义：非电解质在电化学梯度作用下，直接通过膜。

影响因素：脂溶性，分子大小，带电性。

气体分子、小的不带电极性分子、脂溶性分子易通过；大的不带电的极性分子和各种带电的极性分子难通过。

（2）促进扩散

定义：难通过的必需物质在易化载体的帮助下通过膜。电化学梯度下，通过易化载体的构象变化。

易化载体包括：载体蛋白及通道蛋白。

特点：速度快，速度与溶质浓度成正比；饱和性；特异性；可被特异抑制剂抑制。

离子载体：大多数是细菌产生的抗生素，能够极大提高膜对某些离子的通透性。

包括通道形成离子载体（短杆菌肽）、离子运载离子载体（缬氨霉素）。水通道。

3.4.1.2主动运输

（1）概念：膜运输蛋白在代谢能偶联下，逆浓度梯度运输底物，具有选择性，饱和性。

能量来源：ATP，光能，电子流，物质浓度梯度。

（2）分类：初级主动运输，次级主动运输。

（3）主动运输泵

    F型泵：需要ATP供能，不需磷酸化。细菌质膜，线粒体、叶绿体膜上，ATPase。

    P型泵：需要ATP供能，同时需要磷酸化。

    V型泵：需要ATP供能，不需磷酸化，位于小泡膜上。

    ABC型泵，ABC转运蛋白。

（4）意义：建立，维持细胞、细胞器内外环境的物质浓度，以使细胞维持正常生理功能。

3.4.2细菌中的主动运输

（1）基团转移（磷酸化运输）

通过对被转运到细胞内的分子进行共价修饰，纽荷尔精密零件检测显微镜为实验室分析辅助，使其在细胞中始终维持“较

低”的浓度，从而促进运输。

（2）细菌视紫红质质子泵

光能驱动视紫红质构象改变，直接泵出质子，建立质子梯度。

（3）ABC超家族转运蛋白

周质空间由底物特异性受体，捕捉底物，再迁移到膜上。